传统虾酱中酵母菌分离鉴定及碳源利用特性（一） 使虾酱的生产周期长

“虾酱”是传统中国沿海地区及东南亚地区人们常用的调味料之一，是虾酱性以毛虾等小型虾类经腌制、捣碎、中酵发酵制成的母菌糊状食品，其滋味鲜美，分离回味无穷，鉴定及碳具有独特的源利用特风味。我国的传统虾酱生产主要集中在沿海地区，如辽宁、虾酱性山东、中酵天津、母菌江苏、分离广东、鉴定及碳海南等。源利用特

虾酱的传统发酵是一个较为复杂的化学变化过程，传统的虾酱生产通常采用自然发酵，且发酵过程受到季节、天气、温度等诸多不可控因素影响，使虾酱的生产周期长，品质不稳定，不利于大规模工业化生产。国内外专家、学者对不同地区的虾酱发酵工艺及品质进行研究。如：吴帅等研究了低值虾酱发酵中的风味变化；苑宁等阐述了虾酱生产过程中的品质变化，以及容易引起食品安全问题的不良因素。还有一部分学者对虾酱中的微生物进行分离，例如：石敏等从侗族传统虾酱分离获得一些具有蛋白酶、脂肪酶以及其它酶类的活性乳酸菌；孙业盈等从蜢子虾酱中分离鉴定出1株中度嗜盐菌MKY2；连鑫等从李锦记公司提供的广东传统发酵虾酱中分离鉴定出产香酵母和产蛋白酶霉菌；吕欣然等在锦州传统虾酱中分离出蛋白酶嗜盐菌。大连因处于黄、渤海交界海域这一独特的地理位置，故造就了大连传统虾酱与众不同的风味和口感，这与其自身特有微生物环境有着密切联系。过去对传统虾酱中酵母菌多样性及特性的研究甚少，也鲜有对酵母菌碳源同化利用特性的研究。

本研究通过对大连虾酱中酵母菌的分离纯化，采用26SrDNA菌株进行种属鉴定，对所分离的酵母进行碳源同化特性研究，所得结果对虾酱发酵优良菌株的筛选以及工艺优化有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品虾酱，大连竹岛食品公司的生制虾头酱。

1.2 培养基与试剂

YEPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母10g/L，pH6.0，121℃灭菌20min。
碳源同化培养基：硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，酵母粉0.5g/L，琼脂粉15g/L，碳源（葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、柠檬酸、壳聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖）20g/L，pH5.8～6.0，121℃灭菌20min。

甘露醇（分析纯）、壳聚糖（分析纯）、甘油（分析纯），天津市光复精细化工研究所；N-乙酰-D氨基葡萄糖，上海晨易生物科技有限公司；D-山梨糖醇，生工生物工程（上海）有限公司；柠檬酸，天津市石英钟厂霸州市化工分厂；蔗糖（分析纯）、乳糖（分析纯）、葡萄糖（分析纯），天津市福晨化学试剂厂。

1.3 仪器与设备

DRP-9162电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；超净工作台，上海博迅实业有限公司；PCR仪，美国伯乐公司；高压蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；凝胶成像系统，以色列DNR公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分离纯化

在无菌条件下，取5g虾酱于45mL无菌水中摇匀，过滤。取合适的梯度进行稀释，稀释后溶液取0.2mL，均匀涂布于PDA培养基平板上，封口后置于30℃培养48h。选取菌落数为30～300的平板，挑取清晰单菌落或不聚成堆菌落重新平板划线分离，培养一定时间后，挑取单菌落，在PDA平板上划线纯化，直至得到纯种单菌落，观察并记录菌落形态，置于4℃保存备用。

1.4.2 菌株的形态学鉴定

观察分离纯化后酵母菌的菌落形态特征，从颜色、光滑度、致密性等方面观察并记录。取典型菌落进行镜检，于40倍物镜下观察菌体形态并采集图像。

1.4.3 酵母菌的碳源同化

共配制9种碳源同化培养基，9种碳源包括葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、柠檬酸、壳聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

将分离纯化后的酵母菌分别接种于9种培养基平板上，30℃培养相同时间，取出后观察各培养基上每种酵母菌的生长状况，进行对比，总结每种酵母菌适宜的碳源生长条件，并采集图像。

1.4.4 菌株基因组的提取

取保藏在-20℃的菌株，加入1mL纯净水悬浮，13000r/min离心30s。再加入400μLTES和0.3g左右的玻璃珠，室温放置5min。冰浴1min，用涡旋振荡仪（最大功率）振荡1min，反复5次。再加入200μL饱和酚溶液，200μL氯仿异戊醇，室温作用5min。冰浴1min，振荡1min，反复5次。13000r/min4℃离心10min。取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，2倍体积冰冷无水乙醇，-20℃沉淀20～60min。13000r/min4℃离心10min，弃上清，加入1mL75%乙醇，颠倒反复洗涤沉淀，13000r/min离心2min，弃上清，晾干。加入适量的TER（1mLTE缓冲液中加入1μL10μg/μL的RNA酶），37℃温育20min。取1μL进行电泳，与λHindⅢmarker电泳条带进行比较，采用凝胶成像仪观察并采集图像。

1.4.5 菌株26SrDNAPCR扩增

PCR采用通用引物26S1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，26S2：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’进行扩增。

PCR反应体系（50μL）：10×PCRBuffer5μL，dNTP4μL，Taq酶0.5μL，模板2μL，超纯水36.5μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃20s，50℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃∞。取PCR产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.6 DNA测序及系统发育树建立

PCR产物的测序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。将所得序列在NCBＩ数据库中进行BLAST同源性比对分析，得到序列后用软件MEGA5.2进行分析，制作成系统发育树。

2 结果与分析

2.1 虾酱中酵母菌的分离与鉴定

2.1.1 菌落的形态学观察结果

以大连传统虾酱为原材料，以PDA为培养基，共分离纯化出8株酵母菌。该8株酵母经过多次平板划线分离纯化，确定为纯菌落，分别编号为Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8。对以上8株酵母菌进行形态学观察和显微镜检测，菌落形态及镜检结果如图1所示，各自具体菌落形态学描述见表1。由图1可见，这8株菌株中有2株菌为红色，从菌落形态上看，表面光滑，不透明，产生红色色素。其余均为白色，表面光滑湿润，不透明，多呈白色，菌落的透明度、颜色都有所差异，其中，有2株白色菌株的菌落边缘呈模糊状态。通过镜检可知，所分离的菌株大小符合酵母菌的大小，可进一步采用分子生物学的方法对其进行鉴定。

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